2014年日本高中老师无壳孵化小鸡论文

一种使用塑料薄膜作为培养容器的新型无壳鸡胚胎培养系统(A Novel Shell-less Culture System for Chick Embryos Using a Plastic Film as Culture Vessels)

最近朋友想做无壳孵小鸡的实验,找来了日本中学老师的论文,翻译了一下。希望能帮到之后的工作。

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摘要

高孵化率的鸟类胚胎无壳培养方法的发展,对于有效繁殖转基因鸡,胚胎操作,组织工程学,以及再生医学的基础研究是有帮助的。目前为止,鸟类胚胎的培养方法包括使用窄窗口蛋壳的整胚胎培养,代用蛋壳,以及使用透气薄膜的人造容器。为了建立高孵化率的简单鸡胚胎培养方法,我们实验了不同的培养条件,包括补充钙质和通入氧气。在孵化55-56小时后转移的胚胎培养中,使用聚甲基戊烯薄膜作为培养容器,同时补充乳酸钙和蒸馏水的情况下,超过90%的胚胎活到了第17天。为17天的胚胎通入纯氧,最终产生了57.1%(14个中的8个)的孵化成功率。因此,我们使用人工容器方法成功实现了高孵化率。
关键字:人工容器,鸡胚胎培养,孵化,无壳,聚甲基戊烯

引言

无壳培养,即把鸡胚胎从蛋壳中取出并在人工环境中培养,是生产转基因鸡的重要技术,它们的蛋中可以产生各种胚胎操作中有用的物质 (Kamihira 等人, 2005; Kyogoku 等人, 2008)。另外,如果这项技术应用到拯救损坏的蛋,可以帮助珍稀鸟类的保护。然而,蛋壳的开窗导入基因以及其他的操作会显著降低孵化成功率(Andacht 等人,2004)。通过直接观察胚胎的发育,鸡胚胎的无壳培养技术也可能在学校的生命科学教育中扮演重要的角色。
Perry(1988)报告了使用替代蛋壳作为培养容器的鸡胚胎培养方法,用于从雌性输卵管中取出的单细胞受精卵的前卵(ex ovo)培养。这种方法由三个系统组成:系统I用于从单细胞状态到胚盘状态的胚胎,系统II用于胚盘状态到第3天的胚胎,系统III用于从第3天到孵化成功的胚胎。胚胎在三个系统中培养并且从一个容器转移到另一个容器。一个大蛋壳被用作系统III的培养容器。然而,这种方法的孵化成功率只有7% ,之后Naito 等人在1990年把它提高到50%左右。一些培养方法使用代用蛋壳培养鹌鹑(Ono 等人., 1994;Kamihira 等人., 1998; Ono 等人., 2005; Kato 等人., 2013)
Kamihira 等人(1998)年报告了使用PTFE透氧膜构成的人造容器的鹌鹑胚胎的无壳培养技术。在他们的方法中,超过43%的鹌鹑胚胎在补充钙的条件下孵化成功。这个系统对应于Perry的系统III,并且这种培养方法同样被用于鸡胚胎 (Kamihira 等人.,
2004)。
鸡胚胎培养的各种改建都被报道了,然而,许多方法都包括了用从产更大卵的不同种鸟类得到的蛋壳作为代用蛋壳,如aigamo 鸭和火鸡(Borwornpinyo 等人., 2005)。然而,使用代用蛋壳的培养方法有很多弊端,如准备蛋壳,不同批次蛋壳的差异,无法循环利用,和胚胎操作过程中低可操作性等。
为了建立一个高孵化成功率的简单培育方法,我们使用方便的透明玻璃杯而不是代用蛋壳作为人工容器,并且试验了如补充钙和水,以及通入氧气等培养条件。

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图1 **处理聚甲基戊烯膜。** 为了准备培养容器,握住大约30平方厘米的薄膜的左右两边并拉伸到合适的形状(A)。然后,握住保持松弛的边以同样的方式拉伸薄膜(B)。这样就造出了一个蛋形状并且和蛋尺寸相当的薄膜。之后薄膜被装有塑料杯的吸气机吸气,塑料杯与人造容器直径相同。这也是防止薄膜在装到人造容器上时起皱。

材料和方法

鸡蛋

本研究使用的所有受精卵都是Dekalb 棕鸡蛋,一种从杂货店买到的鸡蛋(Yamagishism Jikkenchi, Mie, Japan)

培养容器

一个430ml的聚苯乙烯塑料杯用作培养容器的囊。在距离杯子底部大约2cm的位置开一个直径1-1.5cm的洞,洞口堵上棉絮作为过滤器。一个直径2mm的塑料管(源自多用途管,日本东京原子医药生产)插入棉絮和洞之间的空隙提供氧气供应。杯子中加入40ml 0.01%的氯化苯甲烃胺溶液(OSUBAN-S,日本制药生产;用蒸馏水稀释)。聚甲基戊烯膜(FOR-WRAP,日本理研公司生产)被制成凹陷形状,小心地防止收缩(图1)然后作为人造培养容器装到杯子上。

胚胎培养

受精鸡蛋在38℃,相对湿度60%的孵化器(BITEC-300,Shimadzu RIKA 公司生产)中预培养48-50小时(A组)或55-60小时(B组)。作为胚胎培养的准备,向培养容器中加入250-300mg乳酸钙五水合物粉末(昭和化学生产)。然后轻轻地加入2.5-3ml无菌蒸馏水(大冢制药生产)。每个蛋壳用70%乙醇擦拭,不用钻头打破,整个鸡蛋的内容转移到培养容器(图2 B)。果破碎的蛋壳掉进培养容器,用消毒的医用钳小心取出。
进一步,我们在聚甲基戊烯薄膜上表面做了10个直径5-8mm的通气孔,并不直接接触胚胎。洞通过使用加热的玻璃棒融化薄膜制成。

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图2 **鸡胚胎的人工培养容器** 这幅图中,没有添加氯化苯甲烃胺(胚胎转移前,A图)。鸡胚胎人造培养容器(刚转移完胚胎,图B),棒,1cm

培养容器盖上聚苯乙烯盖子使得容器中的湿度保持在100%左右。培养容器在孵化器中保持38℃和80%湿度。培养容器倾斜大约8°放置,顺时针方向旋转120°,一天转2次。
从培育周期的第17天开始到出壳,以大约500ml/h的速度向之前安装的塑料管中通入纯氧。

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图3 **用于鸡胚胎培养的人造培养容器示意图**
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图4

如果胚胎不能在培养周期的第19至20天自己突破尿囊膜,我们就会在避免大出血的前提下,小心地在鸟喙周围创造一个5mm左右的切口。图4显示了鸡胚胎培养的时间表。完整的没有操作过的受精卵是受控孵化的(n=10)。他们在38℃,80%湿度的孵化箱中孵化,第18天前每天顺时针旋转两次,每次120°。
孵化出的鸡被赠与新的主人,作为宠物被养到性成熟。

统计分析

培养的胚胎在孵化周期第17天以前的存活能力由存活胚胎的数量体现,100%存活率即为开始前卵培养的那天存活胚胎的数量。提供或不提供氧气的孵化率是由孵化成功胚胎数量体现,100%孵化率即开始通风的第17天胚胎的数量。数据使用费舍尔的精确概率法。P值<0.01被认为是有统计意义的。

结论

预孵化周期

对于孵化50小时前转移到培养容器中的胚胎(A组;阶段12-15;Hamburger与Hamilton, 1951),没有活到第8天的。而当培养55-56小时后转移到培养容器中的胚胎(B组,阶段16),第8天的存活率明显高于A组(P<0.01;见表1和图5),17天的存活率为92%(25中的23)。

氧气供应

在人工容器中培养到大约第17天(阶段43-44)期间,尿囊膜血管中血流的颜色变为深红,显示出胚胎缺乏氧气供应。因此,我们通过插入人工容器中的塑料管,以500ml/h的速度通入纯氧。结果是,B组57.1%(14中的8)的供氧的胚胎发育到了孵化。作为对比,没有供氧的组没有胚胎发育到成功孵化(见表1和图6)。因此,通入氧气显著提高了孵化存活率(P<0.01)。

孵化后鸡的成长

本方法孵化出的鸡很健康,可以养到性成熟,并且交配后得到了健康的后代。

完整蛋控制

完整控制胚胎的孵化率为70%(10中的7)并且没有观察到畸形。两枚单在破壳时死亡,另一枚在孵化时由于卵黄囊破坏而死亡。

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图5 **转移前预孵化周期对17天存活率的影响。** 所有的蛋预孵化48-50小时(开环,A组)或55-56小时(闭环,B组) 。观察到两组在第8天和第17天存活率的显著不同。
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图6 **第17天开始是否通入纯氧的胚胎的存活率和孵化率。**第17天-21天期间监控存活率同时计数孵化胚胎的个数。此期间,胚胎在通入氧气(闭环)或不通入氧气(开环)条件下培养。观察到了是否供氧在第21天孵化率的显著不同(*P*<0.01)。
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表1 **使用塑料薄膜作为培养容器孵化鸡胚胎的总结。** —,不供氧;S,供氧;N,未处理。*均为第17天时

讨论

当前的研究中,我们开发了一套使用塑料薄膜作为培养容器的鸡胚胎无壳培养系统,并且通过比较诸如补充乳酸钙和是否供应氧气等因素,试验了胚胎孵化的条件。我们没有使用可透气的PTFE膜,而是使用了廉价,易处理,易获得的保鲜膜。尽管我们测试了几种保鲜膜,包括聚乙烯和氯化聚乙二烯,最终更倾向于使用聚甲基戊烯膜因为它高度透氧(8.0X10^-10 mol/m^2sPa; 数据来自理研科技Riken Technos)。生产培养容器时消除皱褶是很重要的,因为皱褶的存在会导致更低的存活率(数据未显示)。
在我们的研究中,胚胎在蛋壳中预孵化到第3天,之后打破蛋壳把胚胎转移到人工容器中,对应于Perry的系统III。转移胚胎的预培养周期影响到第8天的存活率以及转移到培养容器的成功率。胚胎的转移时间被优化到第3天(Rowlett and Simkiss, 1987; Borwornpinyo 等人., 2005)。在本研究中,48小时与56小时的不同预孵化周期表现出对存活率的显著影响。预孵化55-56小时(阶段16)的存活率明显高些。在我们的预实验中,卵黄膜经常在56小时后(阶段17)转移到培养容器时损坏。60小时后,因为损坏卵黄膜的风险,很难通过打破蛋壳转移胚胎(数据未显示)。
之前Kamihira等人使用鹌鹑的研究(1998)提到了乳酸钙可以高效促进鸟类胚胎发育。在我们的培养系统中,添加乳酸钙同样促进了胚胎发育,并且存活率在添加250-300mg乳酸钙时最高(数据未显示)。因此,补充钙对于无壳培养是很关键的,因为在胚胎发育期间的主要钙质来源为蛋壳(Rowlett与 Simkiss, 1987; Kamihira 等人, 1998)。我们相信补充乳酸钙的量足够满足胚胎发育的要求,尽管对于胚胎发育钙质来源需要进一步的研究。
我们认为向人工容器中通氧气可能造成胚胎水分的蒸发流失。因此,我们首先向培养容器中添加2.5-3ml蒸馏水。此外,当我们把乳酸钙悬浮在蒸馏水中加进去时,存活率下降了(数据未显示),这可能是电解质不平衡或者血钙过高导致。因此,我们首先向培养容器中添加乳酸钙,然后加入蒸馏水,因为这可能有助于胚胎更慢地吸收乳酸钙。
通过本研究中的培养方法中,分布在尿囊膜中的血管在大约第17天时(阶段43-44)变为暗红色,这意味着供氧不足。Rowlett 和 Simkiss (1989)报道了培养在“保鲜膜”制成的人造容器中的鸡胚胎缺氧与低碳酸血症。Kamihira等人(1998)也指出了使用代用蛋壳的胚胎培养在后期阶段的氧气供应问题。因此,我们试验了在培养的后半段通入氧气。在培养的初始阶段通入氧气可能因为氧气的毒性造成存活率下降。本研究中,尿囊膜中血流的颜色在培养初始阶段看起来很正常。因此,对于第17天后的胚胎,我们通入纯氧来防止后期缺氧。结果血流的颜色变为正常,并且14只有8只发育到成功孵化,证明后期供氧对于人工容器的无壳培养是至关重要的。
在第19-20天(阶段45),胚胎开始戳破尿囊膜并且它们的肺呼吸系统被激活,当胚胎不能戳破尿囊膜时,我们划开5mm长的口子助产。这可能导致戳壳后死亡,一种当蛋没有破壳时以固定比例发生的现象。
结果显示,使用本研究中描述的培养容器,55-56小时的预孵化,加入250-300mg乳酸钙,2.5-3ml蒸馏水,第17天(阶段43-44)后以500ml/h的速度通入纯氧,我们实现了最高的孵化率。这些条件下以第17天存货胚胎数为100%参照的孵化率为57.1%(14中的8)。
Borwornpinyo等人(2005)报告了使用火鸡壳和保鲜膜作为转移到Perry的系统III之前的培养容器的鸡胚胎培养方法,实现了以第3天存活胚胎数为100%情况下81.1%的孵化率。尽管我们的培养方法没有使用代用蛋壳,仍旧实现了超过50%的高孵化率。这种方法不需要任何复杂操作,特殊材料或技术。也消除了如不同蛋壳的可用性和质量等不确定性,这在之前使用代用蛋壳的方法中经常带来问题。此外,我们使用透明的塑料薄膜,不光使得从任何角度观察胚胎形态都很方便,而且只要拿走塑料盖就可以进行胚胎操作。目前,提高孵化率的进一步改进正在进行中。
如果我们获得了稳定的孵化率,这种方法就可帮助生产转基因鸡和其他胚胎操作,这些都是再生医学的基础研究。这也可以用于支持组织培养,使用鸟类的胚胎干细胞的研究以及作为生物反应器的鸡蛋的批量生产。

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图7 **从人工容器中刚孵化出的小鸡**

致谢

本研究由日本科学促进会的政府补贴支持(编号23924002)。
我们非常感谢国家农业生物科学学会的Mitsuru Naito博士,日本兽医和生命科学大学的Kimimasa Takahashi 博士。我们也非常感谢千叶县牲畜研究中心的Masayuki Waki博士也为我们提供建议。
我们也感谢来自Masayuki Waki高中,Isobe 高中,Chiba Kogyo高中以及Oihama高中的员工和学生。
我们感谢深红互动有限责任公司(Ulatus与Enago)协助翻译和编辑文稿 。

参考文献

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